影响无菌制剂无菌保证水平的因素

药品是特殊商品，关系到人们的生命安全。《药品生产质量管理规范》 ( good manufacturing practice，GMP) 2010 年修订附录1无菌药品第三条指出：“无菌药品的生产必须严格按照精心设计并经验证的方法及规程进行，产品的无菌或其他质量特性，决不能依赖于任何形式的最终处理或成品检验 (包括无菌检查) ”。笔者从无菌制剂的特殊性、无菌检查方法的局限性、无菌保证水平、无菌产品的工艺设计、无菌安全的保证要素几个方面探讨提高无菌安全水平的对策，以完善产品的质量保证体系，保证药品的质量、疗效和用药安全。

　　无菌制剂的特殊性

　　无菌物品是指物品中不含任何活的微生物， 实际上无法证明产品中没有活的微生物存在， 因为对于任何一批灭菌物品而言， 绝对无菌既无法保证也无法用实验来证实。一批物品的无菌特性只能通过对物品中活的微生物的概率低至某个可接受的水平来表达， 即无菌保证水平 ( sterility assurance level， SAL) 。实际生产过程中，灭菌是指将物品中污染的微生物概率降至预期的无菌保证水平。最终灭菌物品微生物存活概率，即无菌保证水平不得高于 10-6。无菌制剂的生产是一个完整的操作规则体系， 若其中的任何环节被疏忽、 被污染，那么其他环节虽是无菌操作， 也将完全失去意义，都可能导致药品生产不符合质量要求。

　　无菌检查法的局限性

　　无菌检查法是根据《中华人民共和国药典》 内容而建立的一种检查方法。若供试品符合无菌检查法的规定，仅表明供试品在该检验条件下未发现微生物污染。检验结果只是基于“可能性” 的判断 ， 无菌检查方法的局限性在于以下几个方面。

　　1培养液的质量

　　无菌检查所用的培养液只是针对真菌和细菌的检验， 对结果的判断也是基于“是否在培养液中生长”。

　　2培养条件

　　研究表明，《中华人民共和国药典》 规定的微生物培养条件并不是许多细菌和真菌的最适生长条件 。

　　3实验验证

　　微生物的生长除了受培养液的质量、培养条件( 温度、时间) ， 还要受检品特性如检品有无抑菌作用、 供试品的处理方法及实验操作条件等因素的影响，因此要保证无菌检查结果的准确性和可靠性就必须对无菌检查的方法进行验证。

　　4检验数量

　　《中华人民共和国药典》 规定无菌检查是抽样检查，一般是从每批产品中抽取一定数量的单位产品组成样本进行无菌检查， 以此判断整批产品是否符合无菌的要求。无菌产品的污染率(q) 、 无菌检查的取样量(n) 以及无菌检查通过的概率( p) 之间的关系可以用如下数学公式表示: pn = (1-q) n。当固定污染率为 0.1%，抽样 30 瓶时通过无菌检查的通过率为( 1-0.001) 30 = 97.0%， 检出染菌的概率为3.0%; 抽样 100 瓶时， 通过无菌检查的通过率为( 1-0.001) 100 = 90.5%， 检出染菌的概率为 9.5%; 抽样1 000瓶时，通过无菌检查的通过率为(1-0.001) 1.000 = 36.8%，检出染菌的概率为 63.2%。

　　当固定 30 瓶取样量， 假定该产品的污染率为 1.0%，通过计算，该批产品通过无菌检查的通过率为 74%; 如果该产品的污染率为 0.5%，则通过无菌检查的通过率为 86%。通过以上数据可以看出: 样本污染微生物的比例越低， 抽样样本通过无菌检查的通过率就越高，即使增大抽样量也很难检查出污染的部分。因为无菌检查法是一项破坏性实验，因此不可能对整批产品进行 100%的检验，基于抽样检验的无菌检查，存在的局限性是很明显的。虽然产品的无菌检查按《中华人民共和国药典》 规定检查合格，但不能得出产品绝对无菌的结论，这已是一个共识。

　　无菌保证水平

　　2010 版《中华人民共和国药典》 将终端产品的无菌保证要求规定为微生物污染概率不超过百万分之一，而采用无菌制造工艺，其无菌保证水平则为微生物污染概率不超过千分之一。以过滤除菌法为例。过滤除菌法：常用于气体 热不稳定的药品液体或原料的除菌。

　　过滤过程中无菌保证与过滤液体的初始生物负荷及过 滤器的对数下降值 ( log reduction value，LRV) 有关，LRV 系指规定条件下，被过滤液体过滤前的微生物数量与过滤后的微生物数量比的常用对数值。即: LRV = LgN0-LgN。式中: N0 为产品过滤前的微生物数量，N为产品过滤后的微生物数量。每平方厘米有效过滤面积的 LRV 可以达到 7， 即过滤器上游每平方厘米有107个菌，下游可以达到 1个菌的水平。

　　除菌过滤器本身的除菌效率可以达到10-7水平，但是，由于人员操作及环境因素的影响， 产品最终的无菌保证一般只能达到10-3 水平， 远远低于除菌过滤本身的水平。此外除菌过滤器不能将病毒或支原体全部滤除，所以对于除菌过滤法，其生产系统应严格符合无菌生产的 GMP 要求。GMP2010 年修订附录 1无菌药品第五十二条: 应当尽可能减少物料的微生物污染程度。

　　第五十八条: 应当根据所用灭菌方法的效果，确定灭菌前产品微生物污染水平的监控标准，并且定期监控。因此《药品 GMP 指南》 ( 无菌药品，2010 年修订) 在第 6 节药液的配制中提出: 对于固体溶解并进行无菌过滤的产品而言， 起始物料的微生物污染水平应进行控制，通常为100 cfu·g-1[菌落形成单位数(colony forming units，cfu)]，除菌过滤前非最终灭菌产品的微生物限度标准一般为 10 cfu /100 mL。

　　无菌产品的工艺设计

　　无菌生产工艺就是必须在无菌控制条件下生产无菌制剂的方法，无菌产品分两大类即无菌分装的产品和最终灭菌的产品。无论是哪一类无菌产品， 无菌生产工艺都应严密监控生产环境的洁净度， 并应在无菌控制的环境下才能操作。采用无菌生产工艺， 首先在剂型的选择上应选择无菌保证水平高的剂型。如果主药在水中稳定，但不能耐受湿热灭菌，则不宜开发成大容量注射剂，可以开发成小容量注射剂或冻干粉针，因为采用无菌生产工艺制备大容量注射剂因灌装时间长，染菌的风险就大大提高。在其生产过程中，应定期对无菌生产工艺进行验证， 验证内容包括环境空气过滤系统有效性、工艺用水系统、设备和人员清洁及培养液模拟灌装实验等。

　　无菌安全的保证要素

　　无菌安全实际上就是避免染菌， 如果在生产过程中能避免已灭菌的容器设备等受到二次污染就能保证产品的无菌安全。微生物的来源主要有以下 3 种。

　　1人员

　　人是洁净区环境的最大污染源， 因为人员几乎涉及到所有的生产步骤，人员的活动量将直接影响整个洁净区的环境质量，在无菌室由操作人员引起的污染将达到总污染原因的 95% 。研究表明，洁净室内的工作人员穿无菌服时，静止状态的发菌量一般为每人每分钟 10 ～ 300 个， 躯体一般活动状态为每人每分钟150～1 000 个，快步行走状态为每人每分钟 900 ～ 2 500个，咳嗽一次一般为每人每分钟 70～700 个，喷嚏一次一般为每人每分钟 4 000 ～ 62 000 个。通过对上海地区无菌药品生产企业的核心生产区( 即动态 A /B 或 A /C级) 环境中微生物的污染采样，共收集到微生物分离株265 株，A 级区共收集到 63 株， 占污染微生物总数的23.8%，在 A 级区的微生物污染物类型较多、 较复杂。不同洁净级别区域之间的空气微生物污染程度由低级别向高级别递减，但表面微生物污染程度在各洁净级别之间的差异不大。这说明空气净化和物理隔离可以有效阻断大部分微生物的传播，但接触和操作引起的污染仍是生产企业面临的主要问题。

　　2工艺用水

　　注射用水与注射剂在生产过程中污染可能性最高的发热性物质就是细菌内毒素。细菌内毒素由革兰阴性菌产生， 而水源性微生物绝大多数为革兰阴性菌，这类微生物不会形成芽孢， 故不耐热， 通过灭菌手段可将其杀死， 但该类细菌的细胞壁外层上有一层特殊的结构， 它在细菌生长繁殖过程中并不分泌到介质中，也不能从外壁上自然脱落，不是细菌的代谢产物，当细菌死亡、解体后才显示出一系列内毒素的生物活性。细菌内毒素具有耐热性， 需用干热灭菌(250 ℃，30min 以上)才能去除。细菌内毒素会使人致病甚至死亡，对药品质量产生不良的影响。

　　3环境

　　空气中的微生物基本为革兰阳性菌，根据有关的资料报道 : 人葡萄球菌和唾液链球菌为人体携带的常见菌种，而沃氏葡萄球菌、藤黄微球菌和芽孢杆菌均为常见环境菌。产生芽孢的细菌都是革兰阳性菌 ，芽孢对热、干燥、辐射、化学、消毒剂等理化因素均有强大的抵抗力，其中含有吡啶二羧酸钙，更增加了对热的抵抗力。如果芽孢被环境中的尘埃包围， 这类芽孢的耐热性可能会更强，更不易被杀死。

　　提高无菌安全水平的对策

　　1重视无菌检查法的方法学验证

　　无菌检查法常见的问题： 对检验方法的验证、 培养时间的选择和结果判断缺乏系统的评价。所以，应综合分析实验中遇到的所有情况，最终形成一份详细的、严谨、具有可操作性的验证报告，并且建立该品种的标准操作规程( standard operation procedure， SOP) ，在规程中应对样品的取样量、无菌检查方法的选择、集菌培养器的型号、稀释剂及冲洗液的选择、每次冲洗液的用量和冲洗次数都应有说明。研究表明， 同一品种使用适于抗菌性供试品专用培养器( KSF330， 0.45 μm) 比使用适于非抗菌性供试品普通培养器 ( CN330， 0.22 μm;PY330，0.45 μm) 所需冲洗量少一半; 不同的品种所需的冲洗量不同，选择不同的冲洗液所需的冲洗量不同。对待无菌检查结果要进行科学分析， 如果无菌检查结果合格，不能得出该批产品绝对无菌的结论，如果无菌检查不合格，则可以判定该批产品染菌的结论。不能出现假阴性( 阳性对照为阴性) 时漏检， 当结果为阳性时，违反《中华人民共和国药典》 规定进行复检。

　　2全面、细致、周到的质量管理

　　目前已经过了 GMP认证的无菌制剂生产企业，均建立了完善的质量管理体系和一系列管理制度。但任何一项规章制度都无法阻止违规现象的发生，能否有效执行是关键。在生产中可能会出现很多违规现象，但是在管理方面却没有任何的证据。例如对传递窗使用的管理，传递窗的作用就是防止物品在传递过程中受到污染和避免交叉污染，对传递窗的使用有几个要求: 传递窗的自净时间、 紫外线的照度及照射时间。而现在多数的传递窗的按钮设置就是一个最基本的电源开关，工作人员自行操作时会严格按标准操作规程执行吗? 如自净时间确认为30 min，有些操作人员为了赶时间， 只用15 min。再例如， 对于无菌操作间，进入人员的数量是有严格规定的， 但有时车间为了赶进度或由于其他原因可能会增加人数，这些操作都是违规的，所以为了能全面、细致、周到地执行和实施GMP，建议从以下几个方面进行改进。

　　人员培训

　　GMP 培训是提高药品生产企业人员素质的有效手段， 人员素质的不断提高是保证药品质量的基础。应对员工开展各类培训， 对不同员工所在岗位需要掌握的知识和技能进行针对性培训， 对培训效果进行考核。保障员工掌握本岗位的基本理论知识、 操作规程和实际操作技能。同时，要经常对员工进行药害事件的宣传教育工作，增强责任心，使其在工作中自觉地按照标准操作规程操作 。无菌药品的微生物污染是影响药品生产质量和引发不良反应事件的主要因素之一。微生物是无处不在、 无孔不入的， 反复进行无菌概念的培训是加强无菌概念的有效办法。反思现行的无菌培训， 内容多是微生物学和进出洁净室的规程，由于操作规程中不可能事无巨细，员工在实际生产中遇到规程中没有规定的情况， 常常会违反无菌操作的原则[ 11] 。特别要加强对外部施工人员和维修人员的培训工作， 当他们在生产期间需进入生产洁净区时应当对其进行详细的指导和监督。在实际生产中，往往会出现这样的情况， 当设备出现小故障时， 为了使生产能正常进行，或者出于迫切完成任务的考虑，维修人员会做出一些违规动作， 如果没有较强的无菌

　　概念，就会导致污染。

　　工艺用水

　　有效控制水系统的微生物污染水平及细菌内毒素的水平， 企业内部应设立警戒水平及纠偏限度，以便及时发现不良趋势，采取相应措施。

　　环境管理

　　环境管理的主要思想是防止污染和交叉污染。生产环境包括: 空气、 设备、 设施以及操作人员。环境监测是用来评估生产环境控制是否有效的一个工具。检测项目包括悬浮粒子、 空气浮游菌、 沉降菌、 设备和设施表面的微生物以及操作人员的卫生状况监测等。环境中悬浮粒子的有效控制， 在很大程度上解除了尘埃包裹芽孢的可能， 避免了难以灭菌的风险。沉降菌、 浮游菌及表面微生物这 3 种监测的原理是不同的，针对不同的微生物， 不能完全相互替代。通过对洁净室 /区空气、 设备、 设施表面以及操作人员表面微生物的采集， 除了通过菌落计数了解微生物的浓度外，还应包括对培养出来的污染微生物进行鉴别，通过鉴别可了解洁净室的清洁、 消毒步骤的有效性或缺陷性，特别是对消毒剂有效性评估有所帮助，微生物鉴别的结果也对调查和消除污染源有帮助。

　　设备的管理

　　在企业的生产过程中，设备与设施如同战场上的武器一样，平时必须要注重保养和维护，并且要制定有效的短、 中期维修计划，确保设备正常运行，这样才能在实际操作中发挥良好的作用，不会给生产带来负面影响。

　　3注重无菌生产工艺验证

　　要定期进行培养液模拟灌装验证，证明经过完整的生产过程，产品污染率的目标为零。培养液模拟灌装在某种意义上是一种挑战性实验，使用培养液作为药品的替代品进行无菌模拟生产，对无菌工艺进行验证。因为几乎在所有情况下，微生物在培养液中的繁殖和生长比在实际产品中更容易。GMP( 2010 年修订) 附录 1 无菌药品中第四十七条提出: 培养液模拟灌装实验的首次验证，每班次应当连续进行 3 次合格实验， 空气净化系统、 设备、 生产工艺及人员重大变更后，应当重复进行培养液模拟灌装实验，培养液模拟灌装实验通常应当按照生产工艺每班次半年进行一次，每次至少一批。

　　4现场监督

　　现场监督是质量保证(quality assurance，QA) 的一部分。QA就是为了满足品质的要求而进行的全面有效的质量管理活动。QA人员的主要职责就是对生产全过程进行控制， 纠正生产过程中出现的差错及不规范行为， 做到防患于未然。QA人员工作的性质就是要找别人的缺点与不足，为了起到警示作用还必须对不规范行为进行扣罚。QA人员最容易犯的错误就是遇见问题总是搬出文件规定，命令操作人员执行，当生产过程中出现异常情况时也只会让操作人员停下来并且一味强调要如何处分或者威胁当事人，这样说和做的结果不仅不能解决问题，反而会增加当事人对QA人员的反感， 以后 QA人员的管理工作会更难开展。

　　更可怕的是操作人员会有意隐瞒生产现场的任何问题， 这样一来质量风险会越来越大。GMP 规范和《中国人民共和国药典》的标准是不可逾越的，为此需要寻找各种可行的办法， 所以要求 QA人员必须具有理论知识和实践经验，既精通GMP法规，熟知生产工艺，又要懂得设备的操作，并且还要具有良好的与人沟通的能力。在现场发现问题时，QA人员能和操作人员共同分析问题， 从根本上帮助操作人员解决问题， 得到操作人员的理解和尊重，这样才能使QA工作进入良性循环。